作者：高原/李艷/蘇星光

　　1引言

　　石墨烯是一種由純碳原子的六元環(huán)平面結(jié)構(gòu)構(gòu)成的二維材料，是零維的富勒烯、一維的碳納米管（CNTs）以及三維石墨結(jié)構(gòu)的構(gòu)筑基元。它具有非常大的理論比表面積、很高的楊氏模量、超高的光學(xué)透過(guò)率、優(yōu)良的導(dǎo)熱性和導(dǎo)電性，并能夠通過(guò)電子轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)熒光猝滅。目前，人們已將基于石墨烯的材料廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，如吸附劑、催化劑、藥物載體等。石墨烯具有的奇特性質(zhì)，使得其能夠滿足高靈敏性傳感器設(shè)計(jì)的需求，并已用于構(gòu)建光學(xué)、電化學(xué)及場(chǎng)效應(yīng)傳感器、細(xì)胞標(biāo)記及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等。本文介紹了基于石墨烯材料的光學(xué)生物傳感器的研究進(jìn)展，重點(diǎn)評(píng)述了基于石墨烯基的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）以及比色法傳感器。

　　2基于石墨烯的熒光共振能量轉(zhuǎn)移傳感器

　　熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是能量由供體熒光團(tuán)經(jīng)無(wú)輻射途徑轉(zhuǎn)移給受體熒光團(tuán)，并引起供體熒光猝滅和受體熒光增強(qiáng)的光學(xué)現(xiàn)象，是測(cè)量活體及體外納米尺度距離及變化的有效手段。近年來(lái)，人們致力于開(kāi)發(fā)基于石墨烯材料的FRET傳感器，將其用于生物及化學(xué)檢測(cè)。FRET傳感器主要由3部分構(gòu)成：供體、受體（猝滅劑）及供受體之間的橋聯(lián)媒介。在基于石墨烯的FRET傳感器中，石墨烯及其衍生物既可以作為供體，又可作為受體。一方面，石墨烯由于其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，能夠同時(shí)猝滅發(fā)射波長(zhǎng)或結(jié)構(gòu)不同的多種熒光團(tuán)的熒光，是一種通用的猝滅劑；另一方面，石墨烯及其衍生物經(jīng)過(guò)一定的化學(xué)處理，可以產(chǎn)生熒光信號(hào)，可作為熒光供體?；谑┑腇RET生物傳感器依托于一些生物分子構(gòu)建的橋聯(lián)基，用于調(diào)節(jié)供體熒光團(tuán)和受體之間的距離，從而引起熒光的變化。其中，DNA、蛋白質(zhì)、多肽等生物分子均可以作為橋聯(lián)基。

　　2．1以石墨烯作為猝滅劑

　　在報(bào)道的基于石墨烯材料的FRET傳感器中，以石墨烯材料作為猝滅劑的居多。氧化石墨烯（GO）是石墨烯的一種重要衍生物，是化學(xué)還原法制備石墨烯的前驅(qū)體，在石墨烯片層結(jié)構(gòu)的邊緣和表面帶有多種含氧基團(tuán)，如羧基、羥基、環(huán)氧基等。正是由于這些含氧基團(tuán)的存在，使其較石墨烯具有更好的水溶性，可以應(yīng)用于生物體系中。石墨烯及GO由于其大面積的共軛結(jié)構(gòu)，可以作為能量受體猝滅多種有機(jī)染料及量子點(diǎn)的熒光，是一種廣適性的熒光猝滅劑。與傳統(tǒng)的猝滅劑相比，石墨烯材料具有更高的猝滅效率，使FRET傳感器具有背景低、信噪比高、可多重檢測(cè)的顯著特點(diǎn)。

　　2．1．1基于DNA聯(lián)接

　　研究表明，石墨烯能區(qū)分多種DNA分子結(jié)構(gòu)，包括ssDNA，dsDNA以及莖環(huán)結(jié)構(gòu)等。石墨烯及GO由于其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)帶有裸露的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的化合物具有強(qiáng)烈的吸附能力。

　　DNA中的堿基包含六元環(huán)結(jié)構(gòu)，石墨烯會(huì)與裸露的堿基發(fā)生強(qiáng)烈的π-π相互作用、疏水作用等，從而吸附DNA。但是石墨烯與不同分子結(jié)構(gòu)的DNA的結(jié)合能力明顯不同。對(duì)于相同堿基數(shù)量的單鏈DNA（ssDNA）和雙鏈DNA（dsDNA），石墨烯能夠穩(wěn)定吸附ssDNA，而對(duì)dsDNA的吸附能力則較弱。其原因是由于DNA雜交后空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，磷酸鹽骨架將堿基有效屏蔽在其中，使石墨烯無(wú)法與堿基接觸，從而造成結(jié)合能力的減弱。DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的差異也會(huì)導(dǎo)致與石墨烯的結(jié)合能力不同，堿基數(shù)量越多的ssDNA與石墨烯材料的結(jié)合能力越強(qiáng)。正是基于石墨烯對(duì)不同結(jié)構(gòu)的DNA的吸附能力有所區(qū)別，研究者們構(gòu)建了一系列以DNA聯(lián)接的石墨烯基FRET傳感器。

　　(1)利用DNA互補(bǔ)序列

　　2009年，Lu等首次報(bào)道了基于石墨烯的FRET生物傳感器。該傳感器是由標(biāo)記了羧基熒光素（FAM）的ssDNA與GO構(gòu)成。在沒(méi)有目標(biāo)DNA時(shí)，F(xiàn)AM-ssDNA會(huì)吸附到GO表面，造成FAM與GO之間發(fā)生FRET，使FAM熒光團(tuán)的熒光被迅速猝滅；而當(dāng)FAM-ssDNA與目標(biāo)DNA雜交后，會(huì)改變DNA的構(gòu)型并且削弱了FAM-ssDNA與GO之間的相互作用，這就造成FAM-ssDNA從GO表面釋放出來(lái)，增大FAM與GO之間的距離，阻礙FRET，造成FAM熒光恢復(fù)。從而建立了一種用于檢測(cè)特定DNA序列的高靈敏度及選擇性的熒光恢復(fù)檢測(cè)方法。該課題組還運(yùn)用GO作為納米猝滅劑構(gòu)建了一種分子信標(biāo)（MB）探針。傳統(tǒng)的分子信標(biāo)探針兩端分別標(biāo)記熒光團(tuán)和猝滅團(tuán)。而這種新型的分子信標(biāo)探針則只需在一端標(biāo)記熒光團(tuán)，而猝滅劑GO則不需要標(biāo)記。與傳統(tǒng)的分子信標(biāo)相比，該探針不需要復(fù)雜的合成步驟，同時(shí)猝滅更有效、靈敏度更高。更重要的是，由于發(fā)卡狀的DNA在GO表面的構(gòu)象約束大大提高了該探針對(duì)單堿基錯(cuò)配的選擇性識(shí)別能力。其后相繼出現(xiàn)了以量子點(diǎn)（QDs）或Ag納米簇標(biāo)記的ssDNA探針作為信號(hào)報(bào)告基團(tuán)，以GO作為猝滅劑，以類(lèi)似的模型構(gòu)建FRET傳感器，用于特定DNA序列的檢測(cè)。GO能夠同時(shí)猝滅標(biāo)記ssDNA探針的不同顏色的熒光，可利用此性質(zhì)識(shí)別多種與ssDNA探針互補(bǔ)的特定DNA序列，實(shí)現(xiàn)在同一溶液中檢測(cè)多種特定DNA序列。Zhang等構(gòu)建了免標(biāo)記的石墨烯FRET傳感器，用于DNA特定序列的檢測(cè)。當(dāng)體系中不存在目標(biāo)ssDNA時(shí)，探針ssDNA及所用的DNA嵌插染料（SYBRGreenI，SG）都吸附在石墨烯表面；當(dāng)引入目標(biāo)ssDNA時(shí)，由于形成dsDNA，并且SG與dsDNA內(nèi)嵌結(jié)合，從而遠(yuǎn)離石墨烯表面，使熒光恢復(fù)。

　　(2)利用DNA錯(cuò)配

　　DNA在通常情況下遵循堿基互配的原則，即腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）、鳥(niǎo)嘌呤-胞嘧啶（G-C）配對(duì)。但是在某些離子存在情況下，會(huì)有錯(cuò)配發(fā)生，較為常見(jiàn)的有C-Ag+-C和T-Hg2+-T錯(cuò)配。將DNA錯(cuò)配與石墨烯FRET傳感器結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)特定離子的檢測(cè)。Wen等利用熒光標(biāo)記的富含C的ssDNA構(gòu)建了Ag+的熒光傳感器。Ag+的引入可以引起富含C的ssDNA構(gòu)型的變化，當(dāng)體系中沒(méi)有Ag+時(shí)，DNA為柔軟的單鏈結(jié)構(gòu)；當(dāng)有Ag+存在時(shí)，C與Ag+發(fā)生絡(luò)合形成C-Ag+-C，DNA鏈形成剛性的發(fā)卡dsDNA結(jié)構(gòu)。DNA結(jié)構(gòu)的改變使DNA與GO的相互作用發(fā)生改變，從而引起體系熒光改變。Liu等也構(gòu)建了類(lèi)似的平臺(tái)，利用半胱氨酸（Cys）與C-C錯(cuò)配競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Ag+，實(shí)現(xiàn)對(duì)Cys的檢測(cè)。他們首先用足量的Ag+使富含C的ssDNA發(fā)生折疊，形成dsDNA結(jié)構(gòu)，使體系具有熒光。Cys的加入會(huì)奪取C-Ag+-C中的Ag+，使dsDNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)成ssDNA結(jié)構(gòu)，吸附在GO表面，造成熒光猝滅，其熒光猝滅的程度與Cys的濃度成正比。Zhang等則選用一條標(biāo)記了熒光且富含T的ssDNA，利用T-Hg2+-T錯(cuò)配，使ssDNA折疊成dsDNA結(jié)構(gòu)，所以Hg2+的加入會(huì)使最初較低的熒光信號(hào)增強(qiáng)。而碘化物比T-T錯(cuò)配具有更高的與Hg2+結(jié)合的能力，碘化物的加入會(huì)造成熒光信號(hào)的再次猝滅。從而利用GO作為信號(hào)變化器，以Hg2+和碘化物作為激活劑構(gòu)建了一個(gè)簡(jiǎn)單可靠的熒光DNA邏輯門(mén)。

　　(3)利用核酸適配體

　　核酸適配體是一種功能性核酸，它是一段篩選出來(lái)的ssDNA序列，能夠特異性結(jié)合蛋白質(zhì)、小分子或者離子，可作為便利的傳感元件使用。核酸適配體與其特異性目標(biāo)物結(jié)合會(huì)使其構(gòu)型發(fā)生改變，單鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊，阻礙核酸序列中堿基與石墨烯接觸，引起二者距離的改變。例如，選用熒光標(biāo)記的凝血酶核酸適配體構(gòu)建FRET傳感器用于凝血酶的檢測(cè)［27］。首先，熒光標(biāo)記的凝血酶核酸適配體與石墨烯以非共價(jià)鍵結(jié)合，發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，造成體系熒光猝滅；然后向體系中加入凝血酶，該核酸適配體會(huì)特異性結(jié)合凝血酶，形成四鏈體-凝血酶結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與石墨烯的作用力較弱，最終造成體系熒光恢復(fù)。這種石墨烯-核酸適配體傳感器無(wú)論是在緩沖溶液還是血清中均表現(xiàn)出優(yōu)異的靈敏度和選擇性。文獻(xiàn)中報(bào)道了多種基于石墨烯的核酸適配體FRET傳感器，分別用于赭曲霉素A、三磷酸腺苷（ATP）以及粘蛋白1（MUC1）等物質(zhì)的檢測(cè)。由于核酸適配體能夠選擇性識(shí)別目標(biāo)物質(zhì)，區(qū)別其它結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，所以核酸適配體傳感器都具有較好的選擇性，可用于檢測(cè)稀釋的實(shí)際樣品中的待測(cè)物，如稀釋的血清、細(xì)胞提取液、紅酒等。文獻(xiàn)中也報(bào)道了無(wú)標(biāo)記的核酸適配體傳感器。吖啶橙（AO）由于其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)能夠吸附在還原的GO（rGO）表面，造成AO熒光猝滅。而G-四鏈體結(jié)構(gòu)的核酸適配體（PS．M）能夠捕獲吖啶橙，使AO從rGO表面脫離，恢復(fù)熒光。但是向AO-PS．M/GO混合液中加入血紅素時(shí)，PS．M就會(huì)與血紅素發(fā)生特異性結(jié)合，釋放出AO，AO再次與GO結(jié)合導(dǎo)致熒光猝滅。該方法實(shí)現(xiàn)了血紅素?zé)o標(biāo)記定量檢測(cè)，檢出限為50nmol/L。

　　(4)利用脫氧核酶(DNAzyme)

　　DNAzyme也是一種功能性核酸，具有催化功能以及識(shí)別目標(biāo)分子的能力。DNAzyme可以與其對(duì)應(yīng)的基底形成DNAzyme-基底雜化體，在特定離子的共同作用下，DNAzyme發(fā)揮其催化活性，將基底從斷裂位點(diǎn)上剪切開(kāi)。Zhao等報(bào)道了一種基于GO-DNAzyme的Turn-on傳感器，用于Pb2+的熒光放大檢測(cè)。該傳感器中以FAM標(biāo)記的GR-5DNAzyme-基底雜化體作為分子識(shí)別模塊及信號(hào)指示器，以GO作為猝滅劑。GR-5DNAzyme表現(xiàn)出更高的信噪比及更好的選擇性。與之相反，Wen等則利用8-17DNAzyme構(gòu)建了一種Pb2+的Turn-off熒光傳感器。同樣，采用Cu2+依賴的標(biāo)記FAM的DNAzyme與石墨烯自組裝，就可以構(gòu)建用于檢測(cè)Cu2+的DNAzyme傳感器。文獻(xiàn)中也報(bào)道了無(wú)標(biāo)記的DNAzyme石墨烯傳感器模型。Liu等利用嵌插染料GelRed標(biāo)記Cu2+依賴的DNAzyme的雙鏈或三鏈區(qū)域。GelRed起初只有微弱的熒光，當(dāng)插入DNAzyme的雙鏈或三鏈區(qū)域會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。當(dāng)引入石墨烯后，DNAzyme會(huì)與GO自組裝形成GelRed-DNAzyme-石墨烯復(fù)合物，造成熒光猝滅。由于該DNAzyme的催化活性依賴Cu2+，所以當(dāng)體系中有Cu2+存在時(shí)，該DNAzyme會(huì)發(fā)生斷裂，釋放出GelRed，導(dǎo)致熒光信號(hào)增強(qiáng)。該方法可用于多種待測(cè)物的分析。

　　(5)利用核酸水解酶

　　在核酸水解酶（核酸外切酶或核酸內(nèi)切酶）的作用下發(fā)生的酶切反應(yīng)會(huì)使原有的DNA分子鏈斷裂，從而改變其分子構(gòu)型。例如，脫氧核糖核酸酶I（DNaseI）是一種核酸內(nèi)切酶，它能夠非特異性將DNA剪切成寡核苷酸；但是DNaseI只作用于ssDNA、dsDNA以及DNA/RNA復(fù)合物中的DNA鏈，卻不能作用于RNA。以DNaseI與GO保護(hù)的ssDNA探針構(gòu)成的FRET體系可以用于mi-croRNAs（miRNA）的信號(hào)放大檢測(cè)。其原理是當(dāng)沒(méi)有miRNA時(shí)，熒光標(biāo)記的ssDNA探針會(huì)吸附在GO上造成熒光猝滅；在加入miRNA后，ssDNA會(huì)從GO表面脫附并與miRNA形成復(fù)合物，同時(shí)熒光恢復(fù)。此時(shí)，RNA/DNA復(fù)合物立即成為DNaseI的消化基底，由DNaseI剪切其中的DNA鏈，從而釋放出miRNA，釋放出的miRNA會(huì)與另外的ssDNA探針結(jié)合，進(jìn)入下一輪的剪切循環(huán)。該循環(huán)一直持續(xù)到消耗完所有的探針，所有熒光恢復(fù)，達(dá)到熒光信號(hào)顯著放大的作用。這樣利用多色熒光標(biāo)記的ssDNA探針就可同時(shí)檢測(cè)多種不同的miRNA。Lin等以GO和λ核酸外切酶酶切反應(yīng)為基礎(chǔ)建立了一種簡(jiǎn)單、精確測(cè)定多核苷酸激酶（PNK）活性的方法。首先，熒光標(biāo)記的dsDNA與GO混合時(shí)，體系具有熒光。但是當(dāng)dsDNA被PNK磷酸化后，λ核酸外切酶會(huì)立即從末端剪切dsDNA，剪切后的片段就會(huì)吸附在GO表面，造成熒光猝滅；反之，如果體系中沒(méi)有PNK或者PNK活性被抑制，則不會(huì)發(fā)生剪切反應(yīng)，體系熒光仍保持。Lee等則利用只剪切dsDNA而不剪切ssDNA的核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）作用于5'端標(biāo)記熒光的發(fā)卡型DNA。ExoⅢ從3'端剪切dsDNA直至dsDNA被耗盡，只剩ssDNA，從而造成有熒光標(biāo)記的一段ssDNA序列吸附在GO表面，引起體系熒光猝滅，從熒光猝滅的程度可以衡量核酸外切酶的活性。

　　(6)其它方法

　　Wu等利用解鏈溫度的差異，設(shè)計(jì)了一種用于分析DNA磷酸化反應(yīng)的石墨烯分子信標(biāo)，該分子信標(biāo)可以測(cè)量T4多核苷酸激酶（PNK）的活性，對(duì)單堿基差異具有高特異性識(shí)別能力。該實(shí)驗(yàn)中用到了兩條寡核苷酸（A，B）以及一個(gè)發(fā)卡序列DNA。其中A，B能夠組成與發(fā)卡DNA完全匹配的序列，但是A具有5'-羥基端、B兩端都為羥基端。當(dāng)有PNK存在時(shí)，A和B兩條DNA鏈會(huì)發(fā)生連結(jié)，與發(fā)卡DNA構(gòu)成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，該雙鏈結(jié)構(gòu)具有較高的解鏈溫度，在50℃時(shí)體系具有較強(qiáng)熒光。但沒(méi)有PNK存在時(shí)，A和B兩條DNA與發(fā)卡DNA發(fā)生雜交，形成有可連結(jié)缺口的雙鏈結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致該雙鏈DNA的解鏈溫度較低，在50℃時(shí)解鏈形成游離的發(fā)卡DNA的熒光會(huì)被GO猝滅，基于此原理就可以檢測(cè)T4PNK的活性。Wu等則利用了DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化，構(gòu)建FRET傳感器，用于檢測(cè)猴病毒（SV40）中同型嘌呤同型嘧啶dsDNA結(jié)構(gòu)。這段具有17個(gè)堿基對(duì)的dsDNA結(jié)構(gòu)很容易與熒光標(biāo)記的ssDNA結(jié)合形成三螺旋DNA，使ssDNA從GO表面脫離，造成體系熒光恢復(fù)。Li等利用博來(lái)霉素和Fe2+共同作用使ssDNA斷裂，造成較短的ssDNA鏈段從GO表面的釋放，使體系熒光增強(qiáng)。該方法能夠特異性檢測(cè)博來(lái)霉素的含量。上文介紹了一系列以DNA結(jié)構(gòu)單一改變?yōu)榛A(chǔ)的石墨烯FRET傳感器。Zhang等充分利用DNA不同的構(gòu)型變化，在同一溶液中建立了一種多元檢測(cè)方法。該體系中含有多種熒光標(biāo)記的DNA探針，包括特定序列的ssDNA、核酸適配體、富含胞嘧啶（C）和富含胸腺嘧啶（T）的ssDNA，每種探針以不同顏色的熒光團(tuán)標(biāo)記。利用石墨烯超強(qiáng)的猝滅效率，實(shí)現(xiàn)了同一溶液中對(duì)多種目標(biāo)物的同時(shí)檢測(cè)。

　　2．1．2基于蛋白質(zhì)聯(lián)接

　　蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)也是構(gòu)建石墨烯FRET生物傳感器橋聯(lián)的途徑之一。Liu等認(rèn)為由于石墨烯是二維結(jié)構(gòu)材料，所以能夠突破傳統(tǒng)FRET生物傳感器的距離限制（100），在更大尺度上造成有效的熒光猝滅。該課題組以石墨烯為熒光受體、以CdTe量子點(diǎn)為熒光供體，采用一步熒光免疫法檢測(cè)α-胎蛋白（α-AFP）。首先用α-AFP的報(bào)告抗體Ab5修飾CdTe量子點(diǎn)、并以其捕獲抗體Ab1修飾石墨烯，然后通過(guò)夾心免疫反應(yīng)特異性識(shí)別AFP，形成CdTe-Ab5/AFP/Ab1-石墨烯復(fù)合物，造成CdTe的熒光猝滅，熒光猝滅程度與AFP濃度有關(guān)。同樣，以不同的熒光團(tuán)標(biāo)記不同類(lèi)型的抗體，通過(guò)免疫反應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)多種抗體共同檢測(cè)。Chen等以兩種不同顏色的量子點(diǎn)分別標(biāo)記了腸病毒和柯薩基病毒抗體，以GO為猝滅劑，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腸病毒和柯薩基病毒的同時(shí)檢測(cè)。

　　糖-蛋白的反應(yīng)也可以作為構(gòu)建FRET傳感器的橋聯(lián)基。文獻(xiàn)［45，46］均利用糖-蛋白的反應(yīng)檢測(cè)凝集素（ConA）。以其中之一為例，他們首先合成了一種尾端帶有甘露糖的熒光共軛低聚物（FBT），F(xiàn)BT會(huì)與GO通過(guò)π-π堆積而結(jié)合，并發(fā)生FRET造成體系熒光猝滅。ConA能夠識(shí)別甘露糖單元，與FBT尾端的甘露糖結(jié)合。結(jié)合后會(huì)阻礙FBT與GO之間FRET的發(fā)生。由于不同菌株的凝集素含量不同，所以該傳感器可用于兩種不同大腸桿菌菌株的鑒別。

　　2．1．3基于多肽聯(lián)接

　　Feng等以多肽為橋聯(lián)基構(gòu)建了FRET傳感器。將GO與FITC標(biāo)記的多肽混合，多肽會(huì)與GO形成穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)，通過(guò)FRET使FITC的熒光猝滅。由于該多肽鏈中含有基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）的核心基質(zhì)PLGVR，當(dāng)向體系中引入MMP2時(shí)，該多肽鏈會(huì)被MMP2特異性識(shí)別并剪切成兩段。標(biāo)記了FITC的多肽鏈會(huì)從GO表面釋放出來(lái)，體系熒光恢復(fù)。該傳感器可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)Hela細(xì)胞分泌的MMP2。與其類(lèi)似，Li等報(bào)道了由蛋白酶引起的兩端分別連接有QDs與GO的多肽鏈斷裂，以FRET效率衡量蛋白酶活性的方法。該方法成功應(yīng)用于基質(zhì)金屬蛋白酶以及凝血酶活性的檢測(cè)，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白酶抑制劑活性的監(jiān)測(cè)。多肽與蛋白質(zhì)的結(jié)合也能引起其空間結(jié)構(gòu)的改變，并影響石墨烯與它之間的作用力。Wang等以熒光標(biāo)記的p21（WAF-1）衍生的細(xì)胞周期蛋白A2結(jié)合的多肽序列為探針，以石墨烯為猝滅劑，檢測(cè)早期癌癥的預(yù)后指標(biāo)———細(xì)胞周期蛋白A2。

　　2．1．4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)法

　　石墨烯材料對(duì)芳香族化合物的結(jié)合能力，通常情況遵循六元環(huán)數(shù)量越多結(jié)合能力越強(qiáng)的原則，另外還要考慮分子構(gòu)型、電荷排布等因素。除帶有環(huán)狀結(jié)構(gòu)化合物外，石墨烯及GO還對(duì)一些物質(zhì)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，如Hg2+。文獻(xiàn)中也常利用不同物質(zhì)與GO的結(jié)合能力不同，采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)的方法構(gòu)建FRET傳感器。Huang等以還原的氧化石墨烯（rGO）為納米猝滅劑和吸附劑，構(gòu)建了rGO-有機(jī)染料納米光開(kāi)關(guān)用于Hg2+的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)。rGO對(duì)Hg2+具有高效的選擇性吸附能力及熒光猝滅能力。當(dāng)體系中沒(méi)有Hg2+時(shí)，rGO對(duì)有機(jī)染料造成熒光猝滅，當(dāng)引入Hg2+時(shí)，由于rGO與Hg2+的結(jié)合力更大，使有機(jī)染料從rGO表面脫離，造成體系熒光增強(qiáng)。他們結(jié)合半胱氨酸與Hg2+的反應(yīng)，設(shè)計(jì)了一種rGO的On-off可逆INHIBIT邏輯門(mén)。其它多種物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合也可應(yīng)用于該模型中，如甲基藍(lán)與熒光素競(jìng)爭(zhēng)，酒食黃與熒光素競(jìng)爭(zhēng)，羅丹明6G與ssDNA競(jìng)爭(zhēng)等?；诖嗽恚梢詫?shí)現(xiàn)待測(cè)物的低成本、免標(biāo)記、靈敏檢測(cè)。Cai等則用待測(cè)物與GO競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合熒光供體，實(shí)現(xiàn)了無(wú)標(biāo)記可視化肝素（Hep）的檢測(cè)。該課題組合成了具有熒光的水溶性共軛聚電解質(zhì)（TFP），TFP能夠通過(guò)π-π相互作用和靜電力與GO結(jié)合形成復(fù)合物，使其熒光猝滅。而Hep是一種硫酸鹽化的多糖，帶有負(fù)電荷，與TFP的結(jié)合能力更強(qiáng)，造成體系熒光恢復(fù)。這種方法可以用來(lái)區(qū)分Hep、4-硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸。

　　2．2以石墨烯作為能量供體

　　具有熒光的石墨烯材料還可以作為一種新型的熒光標(biāo)記物，在FRET傳感器中作為能量供體。以具有熒光的氧化石墨烯為熒光供體，以金納米粒子作為受體，分別以DNA雜交和蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)為橋聯(lián)基構(gòu)建FRET生物傳感器，檢測(cè)了特定的DNA序列及病原體。該方法可廣泛用于DNA、蛋白質(zhì)、小分子及離子的檢測(cè)。Chen等報(bào)道了基于石墨烯的光致電子轉(zhuǎn)移（PCT）無(wú)標(biāo)記近紅外熒光生物傳感器，他們合成了在660nm處近紅外發(fā)光的GO，可以通過(guò)π-π相互作用、靜電力以及氫鍵特異性結(jié)合多巴胺。GO與多巴胺的這種結(jié)合會(huì)直接導(dǎo)致GO的近紅外熒光發(fā)生猝滅。該方法可用于人血清樣品及尿液中多巴胺含量的檢測(cè)。

　　3比色法檢測(cè)

　　Song等制備了一種葉酸修飾的石墨烯-血紅素復(fù)合物，該復(fù)合物具有協(xié)同類(lèi)過(guò)氧化物酶的催化活性，可將其用于癌細(xì)胞的快速、特異性、定量檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)采用3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）作為基底。由于石墨烯具有較大的比表面積，并對(duì)疏水分子TMB具有較高的親和性，能夠提高基底TMB的局部濃度，使基底TMB與血紅素催化位點(diǎn)接近，到達(dá)提高催化活性的目的。由于石墨烯具有較高的電導(dǎo)率，所以血紅素與石墨烯之間會(huì)存在電子的傳輸。這種協(xié)同效應(yīng)大大增強(qiáng)了血紅素的催化活性。該復(fù)合物會(huì)通過(guò)葉酸與癌細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)的葉酸受體相連接，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的比色法檢測(cè)。

　　Guo等制備了石墨烯-血紅素復(fù)合物。該復(fù)合物不僅具有血紅素的類(lèi)過(guò)氧化物酶的催化活性，同時(shí)保持了石墨烯能夠分辨ssDNA和dsDNA的能力。石墨烯-血紅素復(fù)合物在高鹽濃度的溶液中易發(fā)生聚集，但是當(dāng)有ssDNA吸附到該復(fù)合物表面時(shí)會(huì)增強(qiáng)該復(fù)合物的抗聚集能力。所以在含有不同的DNA結(jié)構(gòu)的復(fù)合物溶液中加入相同濃度的NaCl，離心后的上清液用比色法測(cè)試，就可以分辨ssDNA和dsDNA。

　　文獻(xiàn)［58，59］是以石墨烯作為過(guò)氧化物酶模擬物（血紅素）的載體，并且石墨烯組分的引入增強(qiáng)了血紅素本身的催化活性，具有協(xié)同作用。他們還發(fā)現(xiàn)GO本身就具有類(lèi)過(guò)氧化物酶的催化性質(zhì)，可用于H2O2及葡萄糖的檢測(cè)中。實(shí)驗(yàn)中羧基化的GO能夠催化底物TMB，在有H2O2存在下發(fā)生顯色反應(yīng)，使溶液顏色變藍(lán)。結(jié)合葡萄糖的氧化反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)葡萄糖在葡萄糖過(guò)氧化物酶的作用下生成的H2O2含量，來(lái)進(jìn)一步確定葡萄糖濃度。該方法可用于檢測(cè)血液樣品及果汁中葡萄糖的含量。Qu等運(yùn)用GO對(duì)氫醌的顯色反應(yīng)具有催化活性，在H2O2存在下將無(wú)色的氫醌氧化成棕色的醌。采用夾心免疫法，建立了可通過(guò)肉眼判斷溶液中前列腺癌腫瘤標(biāo)志物（PSA）含量的比色法。

　　石墨烯與某些金屬及金屬氧化物的復(fù)合物同樣也具有良好的類(lèi)過(guò)氧化物酶的催化性質(zhì)。Liu等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明Au納米粒子和石墨烯本身幾乎不具有類(lèi)過(guò)氧化物酶的性質(zhì)，但是其雜化體Au-石墨烯在其界面上顯示出良好的協(xié)同類(lèi)過(guò)氧化物酶催化活性，可使底物顯色。加入ssDNA或者核酸適配體會(huì)阻止過(guò)氧化物酶基底擴(kuò)散并與活性界面接觸，從而“關(guān)閉”Au-石墨烯雜化物的催化活性。當(dāng)再加入目標(biāo)分析物（如特定的ssDNA序列）會(huì)使原有的ssDNA或核酸適配體的構(gòu)型發(fā)生改變，減弱與Au-石墨烯雜化物界面的作用力，被抑制的催化活性得以恢復(fù)，使底物顯色。該課題組以這種石墨烯雜化材料為基礎(chǔ)，利用其可調(diào)節(jié)的催化活性，設(shè)計(jì)了一種免標(biāo)記比色法平臺(tái)用于特定ssDNA序列檢測(cè)、核酸適配體-蛋白相互作用的研究以及DNA斷裂的監(jiān)測(cè)。GO-Fe3O4復(fù)合物同樣具有類(lèi)過(guò)氧化物酶的性質(zhì)，復(fù)合物中Fe3O4成分的引入不僅賦予了該復(fù)合材料良好的超順磁性，還增強(qiáng)了類(lèi)過(guò)氧化物酶的催化活性?？梢訲MB為底物定量檢測(cè)H2O2，并能夠進(jìn)一步檢測(cè)糖尿病人尿液中的葡萄糖含量。

　　GO不僅具有超強(qiáng)的熒光猝滅能力，還具有顏色猝滅的能力。Fu等利用GO對(duì)Au納米棒的超強(qiáng)顏色猝滅能力，設(shè)計(jì)了一種超靈敏檢測(cè)肝素的方法。以十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）修飾的Au納米棒（AuNRs），能夠通過(guò)靜電力自組裝到GO表面，造成AuNRs的顏色由深到淺的轉(zhuǎn)變。其原因是由于聚陽(yáng)離子魚(yú)精蛋白與GO之間具有更強(qiáng)的靜電力，魚(yú)精蛋白的加入可削弱AuNRs與GO之間靜電作用，阻止AuNRs吸附到GO表面。但是，當(dāng)有肝素存在時(shí)，肝素更容易結(jié)合魚(yú)精蛋白，使AuNRs能夠與GO結(jié)合，隨肝素濃度的增加，溶液的顏色逐漸變淺。

　　4結(jié)語(yǔ)

　　總之，石墨烯材料在光學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用廣泛，其中以石墨烯基FRET生物傳感器的發(fā)展尤為迅速。從目前研究的報(bào)道來(lái)看，國(guó)內(nèi)外研究工作者，特別是中國(guó)學(xué)者，在該領(lǐng)域開(kāi)展了大量的理論和實(shí)驗(yàn)研究，并取得了突破性的進(jìn)展，為石墨烯納米材料在生物傳感器中的應(yīng)用開(kāi)創(chuàng)了新的局面?；谑┑腇RET傳感器主要由供體、受體以及供受體之間的橋聯(lián)基三部分構(gòu)成。石墨烯材料可作為供體或受體之一，并由生物分子構(gòu)建的橋聯(lián)基調(diào)節(jié)熒光供體和受體之間的距離，通過(guò)體系熒光的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)特定組分的檢測(cè)。隨著研究的深入，越來(lái)越多的生物分子的結(jié)構(gòu)變化或反應(yīng)被用作該傳感器的橋聯(lián)媒介。利用石墨烯材料優(yōu)良的性質(zhì)，可提高傳感器的靈敏度；利用生物分子的特異性識(shí)別能力，可提高傳感器的選擇性。但是，石墨烯生物傳感器仍存在一些不足，比如高鹽濃度會(huì)引起石墨烯的聚集和沉淀，影響GO表面電荷的排布，這些都是有待解決的問(wèn)題。在今后的基于石墨烯的光學(xué)生物傳感器的研究中，勢(shì)必將發(fā)展更多省時(shí)省力的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)方法?？傊?，基于石墨烯的光學(xué)生物傳感器的應(yīng)用是一個(gè)方興未艾和值得高度重視的領(lǐng)域。

　　文獻(xiàn)45：WangL，PuKY，LiJ，QiX，LiH，ZhangH，F(xiàn)anC，LiuB．Adv．Mater．，2011，23(38):4386－4391

　　文獻(xiàn)46：ChenQ，WeiW．LinJM．Biosens．Bioelectron．，2011，26(11):4497－4502

　　文獻(xiàn)58：SongY，ChenY，F(xiàn)engL，RenJ，QuX．Chem．Commun．，2011，47(15):4436－4438

　　文獻(xiàn)59：GuoY，DengL，LiJ，GuoS，WangE，DongS．AcsNano，2011，5(2):1282－1290